مقاله بررسی ایمنی زایی ژنهای L7/L12 و P39 در موشهای Balac

مقاله بررسی ایمنی زایی ژنهای L7/L12 و P39 در موشهای Balac
رشته تحصیلی : دامپزشکی

فرمت فایل : doc

تعداد صفحات : 62

حجم فایل (به کیلوبایت) : 40

فرمت دانلود : رار/ زیپ

مبلغ : 5000 تومان

خرید و دانلود

مقاله بررسی ایمنی زایی ژنهای L7/L12 و P39 در موشهای Balac

هدف از این تحقیق بررسی ایمنی زایی ژنهای L7/L12 و P39 در موشهای Balac است. بنابراین پس از جداسازی و تكثیر ژنهای فوق مراحل زیر در این تحقیق انجام گرفت.

1- لكون نمودن ژنهای فوق در یك ناقل انتقال دهنده Cleaning vector

2- تعیین ترادف نوكلئوتیدی ژنهای جداشده و مقایسه آن با ژنهای L7/L12

3- كلون نمودن ژنها در پلاسمید بیان كننده پروكاریونی Procaryotic expression vector

4- تولید و تخلیص پروتئینهای L7/L12 و P39

5- كلون نمودن آنها در پلاسمید بیان كننده اوكاریوتی Eucaryotic expression vector

6- هاری كردن پلاسمیدهای فوق از آندوتوكسین

7- تزریق پلاسمیدها، بسویه واكنش و سویه بیماریزا بروسلاآبورتوس به موش Balb/C

8- سنجشهای ایمونولوژیك

باكتریها و پلاسمیدهایی كه برای انجام این پایان نامه استفاده دشه اند بترتیب زیر می باشند:

باكتریها: بروسلاآبورتوس سویه های 19S و 544 اشدیشیالكی سویه

اشریشیالكی سویه BL21 – اشریشیاكی سویه BL21(DE3(Plyss

پلاسمیرها: PGEX4T1 – PRT 28a – SK+(pSK) - Pblue Script-PCDNA3

با استفاده از عوامل پایه ای، ژن مورد نظر را می توان با استفاده از آنزیم تك پلی مرآز Tag Polymerase تكثیر نمود. عوامل پایه ای ذكر شده شامل موارد ذیل است.

1- قالب

2- پرایمر جلو Forward

3- پرایمر عقب Revers

4- دروكسی نوكلئوتیدها LNTP

5- منیزیوم

6- بافر

7- آنزیم پلی مرآز

8- آب مقطر استریل

برای تهیه پرایمرها ابتدا باید آنها را طراحی كرد. برای طراحی پرایمرهای ژن L7/L12 و P39 ابتدا مترادف نوكلئوتیدی ژنهای فوق را از مركز اطلاعاتی NCBI بدست می آوریم.

- كلونینگ ژنهای L7/L12 و P39 در كلونینگ pSK+:

برای كلونینگ ژنهای فوق ابتدا باید ژنها تحت اثر آنزیمهای BamHI و xhoI قرارگرفته، سپس ناقل پلاسمیدی pSK نیز با آنزیمهای اخیر برش داده شود.

1- برش آنزیمی ژنهای L7/L12 و P39 با آنزیمهای BamHI و xhoI.

1-    برش آنزیمی پلاسمید pSK با آنزیمهای BamHI و xhoI پلاسمید pSK در حدود kb96/2 وزن دارد. این پلاسمید دارای یك ناحیه تكثیری ColE1، یك ناحیه مقاومت به آمپی سیلین تحریك ناحیه f1 origin و یك ناحیه بنام multiple cloning site=MCS كه جایگاه تعدادی از آنزیمهای تحدیدی را در خود دارد. برای تكثیز پلاسمید فوق از باكتری اشدیشیاكلی  استفاده می گردد.

2-    برای برش آنزیمی این پلاسمید ابتدا باكتری حاوی این پلاسمید  را تكثیر میدهد. در ضمن تكثیر باكتری پلاسمید مورد نظر در باكتری همانندسازی كرده و تعداد آن افزایش می یابد. برای تكثیر باكتری از كشت آن در ml2 محیط LB حاوی ng/ml50 آنتی بیوتیك آمپی سیلین استفاده می شود. پس از 18 ساعت كشت مورد نظر كدورت مناسب را پیدا میكند. پس از آن پلاسمید از باكتری تخلیص میگردد.